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一、 實驗儀器與試劑

 表格一：實驗儀器

 表格二：試劑

二、 實驗步驟

1、樣本處理

4℃ 12000rpm 離心收集細(xì)胞，棄上清。PBS 清洗 1 遍后，加入 1mL Trizol 充分混勻。

2、兩相分離 每個樣品中加入 0.2 mL 的lv仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩管體，室溫靜置 5min。4℃下 12000rpm

離心 15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層和上層的無色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的體積大約是勻漿時加入的 Trizol 試劑的 60%。

3、RNA 沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。加入等體積的異丙醇，水相與異丙醇混合以沉淀其中的 RNA。混勻并在室溫孵育 10 min 后，4℃ 12000rpm 離心 10 min。

4、RNA 清洗 移去上清液，加入 1 mL 75%乙醇，清洗 RNA 沉淀。振蕩后，4℃ 7500 rpm 離心5 min。

5、重新溶解 RNA 沉淀

去除乙醇溶液，空氣中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 時，先加入無 RNA 酶的水用槍反

復(fù)吹打幾次，然后 55 到 60℃孵育 10 min。獲得的 RNA 溶液保存于- 70℃。

6、反轉(zhuǎn)錄

1) 按下列組份配制 RT 反應(yīng)液

2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s。

3）反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。

7、熒光定量 PCR

引物設(shè)計

按下列組份配制 Realtime PCR 反應(yīng)體系

用漩渦振蕩器將管中溶液*混合均勻，短暫低速離心。

3）點樣。將混合好的液體加入孔板中，每個樣本的每個基因保證3個復(fù)孔,點完樣之后將 PCR 板置于離心機中 2000rpm、2min，然后用錫箔紙將板包好，置于 4 度冰箱中備用。 4） PCR 反應(yīng)

Real time PCR 儀使用 ABI7500,PCR 程序已優(yōu)化 將步驟 3 中已點好樣的 PCR 板置于 Realtime PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)：首先是預(yù)變形：95℃/10min

第二步是循環(huán)反應(yīng) 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集熒光) ;72℃/45s 第三步溶解曲線：95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s

三、 結(jié)果與計算（采用 2 - △△ CT 法進(jìn)行分析）

基因相對表達(dá)量

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