美國(guó)Biozellen3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠使用步驟:
A、試劑制備
A基質(zhì)膠:將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘, 確認(rèn)*融解.
C緩沖溶液(1X)制備:使用前將10X C緩沖溶液用冰的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液(例如: 無(wú)血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .
D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.
B、Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備
全部步驟需要在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)操作,操作步驟如下:
1. 將24孔培養(yǎng)板放置于冰上預(yù)冷半小時(shí)。
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5 毫升 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)基均勻混合,并與0.5毫升37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合,最終細(xì)胞密度1*105~1*107cells/mL。
注:請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。
3.取 20-40 微升步驟 2的混合液滴于 步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上,膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。 注: 測(cè)試膠體是否成膠,可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。
4.待膠體成膠后,添加1毫升冰的1X C緩沖溶液,并蓋過(guò)步驟3 的膠溶液,固定 15 分鐘。
5.待15分鐘固定后,小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長(zhǎng)之培養(yǎng)基溶液。
6將含有細(xì)胞的膠于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行7~14天的培養(yǎng),并觀察細(xì)胞球體的形成,按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。
C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序
小心的將培養(yǎng)基吸取移除,并用1X PBS進(jìn)行清洗。
小心的將 1X PBS 吸取移除,并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液,蓋過(guò)膠滴于室溫反應(yīng) 5分鐘。
溫和的用1毫升移液管吸取,直到膠滴*溶解。
將含有細(xì)胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管,用1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘,移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。
D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序
在分離單細(xì)胞前,先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作
1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細(xì)胞球體于37°C混合反應(yīng)。
2. 用1毫升移液管混合,直到細(xì)胞體*分解。
3. 待細(xì)胞球體*分解,加入3倍體積的1X PBS,并用1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10分鐘,并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。
E、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序
1. 準(zhǔn)備Transwell裝置及無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液 (用于稀釋A膠)。
2. A膠 (2X) (貨號(hào):B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘,確認(rèn)*融解。
3. 用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將A膠 (2X)稀釋50倍。
4. 根據(jù)Transwell上室底部面積加入100-120 ul/cm2稀釋后的A 膠稀釋液到Transwell上室中。
5. 將步驟4在4 ℃冰箱孵育30分鐘。
6. 將多余的稀釋液吸出,并在Transwell上室中加入無(wú)血清的癌細(xì)胞系細(xì)胞懸浮液使細(xì)胞濃度約7.5 x 104 cells/well.。
7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為chemoattractant,吸引癌細(xì)胞系進(jìn)行遷移。
F、小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序
1. 將 A膠 (2X) (貨號(hào):B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘,確認(rèn)*融解。
2. 將C緩沖溶液(10X) 貨號(hào):B-P-00002-C)與冰的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無(wú)血清DMEM或內(nèi)含VEGF、heparin的無(wú)血清DMEM) 按1:4比例均勻混合配置。(例如:1 ml C緩沖溶液(10X) 與 4 ml 無(wú)血清DMEM混合,不可用PBS稀釋)
3. 將 A膠 (2X) 與約2*106 cells/ml的癌細(xì)胞系懸浮液按1:1等比例均勻混合配置,癌細(xì)胞系懸浮液最終濃度約為106 cells/ml。
4. 選用21-25 G的針頭 (避免破壞細(xì)胞),抽取0.2-0.3 ml 預(yù)冷稀釋后的C緩沖溶液。(C緩沖溶液用于A膠成膠反應(yīng))
5. 使用步驟4的同一支針管,再抽取0.1-0.7 ml含細(xì)胞的A膠混合液,在冰上孵育五分鐘。
6. 以皮下注射方式注射0.3-1.0 ml至小鼠。(需一次注射完含C緩沖溶液的A膠混合液)
注1: 注射體積可依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖稣{(diào)整,若為血管生成研究注射體積需至少0.5 ml。
注2: 此步驟依實(shí)驗(yàn)需求可執(zhí)行或不執(zhí)行,若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,可于注射完畢后,在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘
,若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,可于注射完畢后,在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘。
7. 培養(yǎng)一至三周后可摘取接種的腫瘤組織。
注3: 若為血管生成研究,應(yīng)注射含VEGF及heparin的A膠,以促進(jìn)血管生成。約三天后,可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。
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